В. П. Вейко1, Ю. Ю. Карлагина1, В. В. Романов1, Р. М. Яцук1, Е. Е. Егорова1, Е. А. Зерницкая2, А. И. Яременко2,
Г. Н. Черненко3, С. Г. Горный4, Г. В. Одинцова1
1 Университет ИТМО, Санкт-Петербург, Россия.
2 Первый Санкт-Петербургский государственныймедицинский университет им. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
3 Санкт-Петербургскийстоматологическийфрезерныйцентр и завод по изготовлению ортопедическихкомпонентов «Lenmiriot», Санкт-Петербург, Россия
4 ООО «Лазерный Центр», Санкт-Петербург, Россия
Разработана технология лазерного формирования биосовместимой морфологии поверхности титановых дентальных имплантатов. Она обеспечивает гидрофильную структуру поверхности, обладающую одновременно микро и нанорельефом. Работа представлена в двух частях. В первой части приведено обоснование физических и функциональных свойств, которыми должна обладать биосовместимая поверхность имплантатов. С помощью лазерного структурирования на поверхности титановых дентальных имплантатов были сформированы супергидрофильные рельефы микро и наномасштаба. Период структурв виде лунок составлял 50 мкм, в виде канавок − 30 мкм. Представлены результаты исследования физико-химических свойств биосовместимой морфологии поверхности.
Ключевые слова: дентальные имплантаты, приживаемость, лазерная обработка поверхности, доклинические исследования, in vitro, in vivo, полный цикл производства.
Статья поступила: 04.06.2020. Принята к публикации: 24.06.2020. Ссылка на источник: https://www.photonics.su/journal/article/8393
Введение
Успешна ли дентальная имплантация сегодня
В современной стоматологии одним из самых популярных, универсальных и эффективных методов лечения является дентальная имплантация. Она позволяет решить не только функциональные проблемы полости рта, но и вернуть первоначальный или придать более эстетичный внешний вид пациентам. Согласно маркетинговому отчету [1] по состоянию на 2015 год в России объем рынка дентальных имплантатов составил порядка 540 тыс. шт., а ожидаемый объем рынка к 2020 году составит 0,8–1 млн шт. Однако далеко не каждый из установленных имплантатов приживается. По статистике 95% [2] установленных имплантатов с успехом функционируют в организме весь срок службы – от 10 до 15 лет – при четком соблюдении всех рекомендаций врача. С одной стороны, процент приживаемости достаточно велик, но это также означает, что пятерым пациентам из ста придется повторно проводить операцию с установкой нового имплантата или, что еще хуже, столкнуться с непредвиденными осложнениями в виде инфекции, потери костной ткани и др., сопровождающих неудачную имплантацию. Основными факторами, определяющими успешность функционирования имплантата, являются: качество проведенной имплантации, гигиена полости рта в процессе эксплуатации импланта, а также характеристики самого имплантата (материал, форма, структура его поверхности). Если первые два фактора определяются квалификацией лечащего врача и ответственным подходом пациента, то в силах производителей имплантатов улучшить характеристики его поверхности. Таким образом, на сегодняшний день существует глобальная цель – повысить степень биосовместимости титановых дентальных имплантатов и срок их службы.
Целью настоящей работы является разработка технологии лазерного формирования морфологии поверхности титановых дентальных имплантов.
Какой должна быть поверхность имплантата
Степень успеха интеграции имплантата в тело пациента в значительной мере зависит от дизайна имплантата и структуры его поверхности, которая будет непосредственно контактировать с костью. В качестве материала для дентальных имплантатов наиболее часто применяются титановые сплавы благодаря их высоким прочностным и коррозионным характеристикам, а также гипоалергенности самого титана [3]. Кроме того, титан является реакционноспособным материалом и спонтанно образует устойчивую плотную оксидную пленку на своей поверхности, что повышает биосовместимость имплантата [4]. Что же касается рельефа поверхности имплантата, то учеными однозначно установлено, что структурированные имплантаты обладают лучшим сцеплением с костной тканью (за счет увеличения площади поверхности сцепления), чем полированные [5]. Развитая поверхность имплантата активизирует прорастание костной ткани внутрь него, микрорельеф облегчает сцепление клеток костной ткани с поверхностью, а нанорельеф способствует адгезии белков к поверхности [6]. Существенно также, что для успешного взаимодействия имплантата с клеточными элементами и биологическими жидкостями, особенно на ранних этапах остеоинтеграции, его поверхность должна быть гидрофильной [7].
В качестве материала имплантата мы остановились на титановом сплаве Ti-6A1–4V, который широко применяется в производстве дентальных имплантатов. Для обеспечения биосовместимости имплантата была поставлена задача получить гидрофильную структуру поверхности, обладающую иерархическим микро- и нанорельефом.
Какие методы применяются для создания биосовместимого покрытия
На сегодняшний день популярным методом структурирования имплантатов остается пескоструйная обработка [8], суть которой заключается в создании неупорядоченного развитого рельефа путем бомбардировки поверхности струей порошка, направляемой под давлением. Для этих целей обычно используют порошки гидроксиапатита, оксида алюминия и др. За пескоструйной обработкой в большинстве случаев следует кислотное травление обработанной поверхности для удаления остатков порошка [9]. Таким образом, данный метод структурирования не исключает остаточные загрязнения на поверхности обработанного имплантата.
Также совсем недавно швейцарская компания Nobel BiocareTM представила на рынке новый дизайн поверхности имплантата, улучшающий его остеоинтеграцию за счет формирования зон с различной морфологией: абатмент с нанопористым (размер наноструктур 69 ± 48 нм) гладким (шероховатость Sa=0,13±0,02 мкм; Sdr=1,7±1%) оксидным покрытием (толщина оксидного слоя 153±5нм); шейка со схожими абатменту характеристиками поверхности (Sa 0,49 ± 0,03 мкм, Sdr 2,1 ± 1,0%, раз- мер наноструктур 43±21 нм, толщина оксидного слоя 142 ± 17 нм); переходная зона с меняющейся к вершине имплантата шероховатостью (от Sa = 0,92 ± 0,16 мкм и Sdr = 107,2 ± 31,5% к Sa = 1,49 ± 0,19 мкм и Sdr = 172,7 ± 18,0%) и толщиной оксидного слоя переходной зоны 7,2±0,3 мкм и вершины 9,9±1,3, размер микропор переходной зоны: 1,1±0,5 мкм, вершины: 1,7±1,1 мкм [10].
Как отмечают авторы, оксидный слой на поверхности шейки имплантата и абатменте обеспечивает дополнительные бактерицидные свойства имплантату в период его приживаемости в организме. Регулирование величины шероховатости, размера пор, наноструктур, а также химического состава поверхности имплантата осуществляется путем тонкой настройки режимов анодирования, подбора величины тока и подходящего электролита. Перечисленные величины структурных элементов и значения шероховатостей взяты из источника [10]. Стоит сказать, что зачастую в ходе процесса анодирования используются сильные кислоты, например H2SO4, H3PO4, HF, HNO3, которые могут оставаться в порах на поверхности даже после стерилизации имплантата [11], что отрицательно сказывается на биосовместимости. В работе [12] замечено, что на анодированном титановом имплантате компании Nobel BiocareTM наблюдается содержание фосфора. Можно предположить, что этот факт указывает на использование фосфорсодержащей кислоты в качестве электролита в данной технологии.
Среди современных производителей дентальных имплантатов необходимо отметить корейскую компанию CSM, которая ввела на рынок имплантаты с поверхностью, модифицированной лазерной обработкой. В результате воздействия излучения твердотельного Nd: YAG лазера, в один технологический этап, без использования химических реагентов, на поверхности имплантата формируется упорядоченный микрорельеф в виде лунок и канавок, благодаря которому имплантаты демонстрируют превосходную остеоинтеграционную способность и функциональную стабильность [13]. Также известно, что структуры, индуцируемые лазерным воздействием на воздухе, обладают хорошей износостойкостью за счет содержания оксинитридов титана [14].
Мы также считаем, что методы на основе лазерного воздействия наиболее перспективны для создания биосовместимой поверхности имплантата. Неоспоримым достоинством лазерной обработки является то, что рельеф поверхности формируется за счет испарения самого материла, без использования сторонних материалов для обработки, таких как корундовые частицы Al2O3, и химических реагентов, например, кислот HCl и H2SO4, что снижает риск отторжения имплантата из-за остаточных загрязнений. Кроме того, лазерная обработка открывает большие возможности для получения сложной многоуровневой морфологии поверхности с заданным химическим составом.
В качестве инструмента для обработки мы выбрали широко используемый в промышленности отечественный лазерный комплекс МиниМаркерТМ 2 [15] на базе иттербиевого импульсного волоконного лазера. Металлы достаточно хорошо поглощают излучение данного лазера с длиной волны 1,06 мкм. Рабочий диапазон плотностей мощности I = [6,9– 63] · 107 Вт / см2 позволяет достичь температуры испарения титана, а сканирующая система (гальванометрические зеркала) совместно с фокусирующей системой (F-тета-линза с обратным фокусным расстоянием 216,1 мм) обеспечивает возможность формирования структур со сложной морфологией.
Формирование биосовместимой структуры на поверхности имплантата
Пока в научном сообществе нет однозначного мнения о том, какая поверхность является самой подходящей для титанового дентального имплантата [16]. Очевидно, что развитый рельеф поверхности – это не единственный критерий для оптимальной остеоинтеграции. Остается открытым вопрос, а какой именно тип рельефа (упорядоченный или неупорядоченный, состоящий из лунок или канавок, или какая–то иная морфология) будет наиболее биосовместимым.
Особый интерес представляет рельеф в виде параллельных микроканавок. По сравнению с неупорядоченным рельефом, сформированным, например, пескоструйной обработкой, микроканавчатая поверхность оказывает влияние на поведение клеток таким образом, что последние растут на поверхности не хаотично, а «выстраиваются» вдоль желобков канавок [17–19]. Важными параметрами при создании такого рельефа являются ширина, глубина и период канавок [20]. От соотношения этих величин зависит, будет ли данный рельеф оказывать влияние, и какое именно на поведение клеток, в данном случае – нейральные стволовые клетки. В случае же, когда ширина канавок много меньше или значительно больше размера клеток, а глубина канавок менее 5 мкм, включаются другие механизмы взаимодействия. И тогда поведение клеток в значительной степени зависит от наноразмерных структур, в частности от их ориентации в пространстве. Помимо этого, наноразмерные структуры влияют на адгезию белков к поверхности имплантата на ранних стадиях остеоинтеграции [21, 22], от которых, в свою очередь, зависит конечное формирование новообразованной костной ткани.
Таким образом, мы выдвигаем гипотезу, что оптимальной морфологией поверхности для титановых имплантатов будет структура с элементами надклеточного размера (20–40 мкм). Потому что она обеспечивает определенную подвижность (двигательную активность) клеток и снабжена субструктурой меньшего (нанометрического) размера, функция которой – обеспечение возможности обмена веществ: доступ воздуха и отвод растворимых продуктов жизнедеятельности (для чего могут понадобиться гидрофобные каналы). Примером подобной структуры на титане является структура, образованная в процессе осаждения продуктов абляции и окисления титана в воздухе (рис. 1) на исходную поверхность титана.
Даже если принять вышеобозначенную гипотезу, то все равно возникает вопрос: какой тип рельефа будет оптимальным − протяженные канавки или отдельные лунки, периодично расположенные на поверхности, или какой-то еще. В исследованиях с нейронами [23] было выяснено, что разные типы рельефов способны оказывать влияние на поведение клеток. Но лишь протяженный рельеф в виде канавок способствует контактному поведению клеток. Подобных данной работе [23] исследований дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в остеогенную группу, например в остеоциты, в литературных данных не встречается.
В настоящем исследовании нами были сформированы структуры двух типов: лунки (Л-структура) и канавки (К-структура). Период, ширина и глубина структур составила от 20 до 40 мкм. Оба типа структур были сформированы при перекрытии импульсов по оси Х порядка 95%.
Упорядоченная Л-структура представляет собой совокупность лунок, в которых должны размещаться клетки. Л-структура была получена при использовании лазерного излучения с плотностью мощности 6,9 · 107 Вт / см2 в двухпроходовом режиме обработки. Лунки расположены равномерно по всей поверхности образца, а их диаметр составляет порядка 40 мкм. Период структуры 50 мкм. Так как данный рельеф формируется при нагреве поверхности выше порога испарения, то при первом проходе лазерного излучения по поверхности образца происходит вынос вещества и моментальное образование микрорельефа в форме канавок. Второй проход формирует такие же канавки, но в ортогональном направлении, аналогичным образом с выносом вещества. В тех областях поверхности, где произошло попадание импульса излучения от второго прохода на импульс от первого, образовались углубления в виде лунок. Между лунками находится область, которая была модифицирована при первом проходе лазерного излучения. Таким образом, наблюдается ярко выраженная сетчатая структура на поверхности титанового сплава (рис. 1с).
Для формирования канавчатой К-структуры использовался многопроходовый режим с плотностью мощности 63 · 107 Вт / см2. Как было сказано выше, клетки одного типа могут быть разного размера и формы в пределах одного диапазона величин, что следует учитывать при моделировании структуры рельефа. Исходя из этого, канавчатая структура была создана за три прохода лазерного излучения с формированием параллельных канавок с шагом 30 мкм от начала предыдущей канавки. Такой режим воздействия был применен для того, чтобы получить канавки разной ширины. Так как этот тип структуры тоже был получен в режимах выше порога испарения, то после первого прохода на поверхности образца возникает рельеф в виде канавок. После второго прохода образовывалась новая канавка, которая частично накладывалась на канавку от первого прохода. Канавка, образованная после третьего прохода, накладывалась на канавку, образованную предыдущим. Таким образом, происходило структурирование промежутков между канавками и поверхность полностью заполнялась структурами, без зазоров между канавок (рис. 1b).
Для исследования модифицированной поверхности был проведен анализ методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с использованием микроскопа Zeiss Merlin с дополнительными приставками Oxford Instruments INCAx-act и системой регистрации дифракции обратнорассеянных электронов (EBSD) Oxford Instruments CHANNEL5 для рентгеновского микроанализа. На рис. 1 приведены СЭМ-снимки исходной (необработанной) поверхности (П-структура) титановых имплантатов (рис. 1а) и имплантатов после лазерной обработки: К-структура (рис. 1b) и Л-структура (рис. 1с). СЭМ-снимки демонстрируют наличие на поверхности титана рельефа разного масштаба: микро- и нанорельефа.
Энергодисперсионный анализ показал наличие кислорода на структурированных поверхностях (табл. 1). Это свидетельствует о наличии оксида титана на поверхности имплантата Специ- алистам известно, что он также обладает хорошей биосовместимостью.
Краевой угол смачивания поверхности всех структур был измерен с помощью подсветки капли LED-источником освещения суммарной мощностью 1 Вт и ПЗС-камеры высокого разрешения ToupCam. В качестве тестовой жидкости использовалась дистиллированная вода, объем капли составил 0,1 мкл. Для определения величины угла смачивания использовалось программное обеспечение Digimizer [27]. Проводились измерения по трем образцам каждой структуры. Фотографии осажденных капель на поверхностях представлены на рис. 2. Согласно результатам измерений, угол смачивания поверхности титана до лазерной обработки составил 70° (рис. 2а). Измерить же угол смачивания поверхностей после лазерной обработки не представляется возможным, т. к. поверхность из гидрофильной превратилась в супергидрофильную (т. е. капля, попав на нее, мгновенно растекается и пропитывает структуру).
Кинетика изменения максимального диаметра dmax растекшейся капли во времени t отображена на графике (рис. 2 b). Стоит отметить, что каждой структуре соответствует разный характер растекания капли: Л-структуре соответствует симметричная овальная область растекания (длинная ось = 1,6 ± 0,1 см, короткая
ось=1,26±0,1 см), а К-структуре – несимметричная вытянутая вдоль желобков канавок и большая по площади (длинная ось=1,5±0,1 см, короткая ось = 3,9 ± 0,1 см). Как известно, смачиваемость играет важную роль в адсорбции белка и клеток на поверхности, а супергидрофильные поверхности способствуют этому [24].
Таким образом, с помощью лазерного структурирования мы сформировали на поверхности титановых дентальных имплантатов супергидрофильные рельефы, состоящие одновременно из микро- и наноструктур.
Эффективность биосовместимости рельефов, сформированных при лазерном воздействии, была выявлена в ходе доклинических in vitro и in vivo испытаний. Их результаты будут представлены во второй части работы. Будет описан алгоритм и технологические этапы технологии на основе данного метода. Технология внедрена в производство стоматологического фрезерного центра полного цикла производства и завода, входящего в группу компаний «ОРТОС».
СЭМ-исследования поверхности имплантантов были проведены в Санкт-Петербургском государственном университете в Междисциплинарном ресурсном центре по направлению «Нанотехнологии» (г. Санкт-Петербург).
Авторы работы выражают благодарность научному коллективу НИУ «БелГУ» (г. Белгород) под руководством Колобова Ю.Р. за помощь в проведении исследований физико-химичских характеристик лазерно-индуцированных структур.
Эксперименты in vitro и протоколы экспериментов были одобрены Советом по этике исследований Нижегородской государственной медицинской академии (Приволжский научно-исследовательский медицинский университет, г. Нижний Новгород) и соответствуют принципам Хельсинкской декларации.
Комитет ПСПбГМУ им. И. П. Павлова осуществляет свою деятельность в соответствии с Конституцией Российской Федерации, законами и другими правовыми актами Российской Федерации и Санкт-Петербурга, Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации от 1964 года, дополненной в 1975, 1983, 1989, 1996, 2000 и 2013 годы, международными стандартами по проведению клинических испытаний ICH Harmonized Tripartite Guideline for Good Clinical Practice (ICH GCP), стандартом отрасли ОСТ 42-511-99 «Правила проведения качественных клинических испытаний в Российской Федерации», вступившим в силу с 1 января 1999 года, рекомендациями комитетов по этике, проводящим экспертизу биомедицинских исследований ВОЗ, Уставом ПСПбГМУ им. И.П.Павлова и Положением об этическом комитете ПСПбГМУ им. И. П. Павлова. Исследование «In vivo исследование процессов интеграции титановых дентальных имплантатов с модифицированной лазером поверхностью» одобрено (выписка из протокола No 208 заседания этического комитета ПСПбГМУ имени академика И. П. Павлова от 25 июня 2018 года).
Авторы работы выражают благодарность научному коллективу ФГБОУ ВО «ПИМУ» Минздрава России (г. Нижний Новгород), в составе Дарьи Кузнецовой, Вадима Елагина и Елены Загайновой, за исследование биоинтеграции клеток на лазерно-индуцированной поверхности титана ВТ6, и сотрудникам Центра коллективного пользования научным оборудованием «Клеточные и молекулярные технологии изучения растений и грибов» Ботанического института им. В. Л. Комарова РАН (г. Санкт-Петербург) Зерницкому А. Ю. и Зотову П. А. за проведение гистологического и гистоморфометрического исследований.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект No 20-62-46045).
Вклад членов творческого коллектива в проект
В проекте принимали участие все члены авторского коллектива: постановка задачи и обеспечение ресурсами – Г. Н. Черненко, С. Г. Горный; концепция, дизайн исследования и руководство проектом – В. П. Вейко, Г. В. Одинцова; проведение экспериментов по лазерному структурированию поверхности титана – Ю. Ю. Карлагина, В. В. Романов, Р. М. Яцук; концепция in vitro и in vivo исследований – А. И. Яременко; проведение и анализ in vivo исследований – Е.А.Зерницкая; анализ результатов in vitro и in vivo исследований – Ю. Ю. Карлагина, Е. Е. Егорова.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Авторы
В. П. Вейко (vadim.veiko@mail.ru), профессор, доктор технических наук, руководитель Международной научной лаборатории лазерных микро- и нанотехнологий, факультет лазерной фотоники и оптоэлектроники, Университет ИТМО, Санкт- Петербург, Россия. ORCID: 0000-0001-6071-3449
Ю. Ю. Карлагина(jujukarlagina@itmo.ru), инженер, Международная научная лаборатория лазерных микро- и нанотехнологий, аспирант, факультет лазерной фотоники и оптоэлектроники, Университет ИТМО, Санкт-Петербург, Россия. ORCID: 0000-0002-6927-9551
В. В. Романов (ionhcik@rambler.ru), инженер, факультет лазерной фотоники и оптоэлек- троники, аспирант, Университет ИТМО, Санкт-Петербург, Россия. ORCID: 0000-0003-1468-9438
Р. М. Яцук (yatsuk.roman@mail.ru), инженер, Университет ИТМО, Санкт-Петербург, Россия. ORCID: 0000-0003-2502-7501
Г. В. Одинцова(gvodintsova@itmo.ru), кандидат технических наук, научный сотрудник, Международная научная лаборатория лазерных микро- и нанотехнологий, Университет ИТМО, факультет лазерной фотоники и оптоэлектроники, Санкт- Петербург, Россия. ORCID: 0000-0001-9581-4290
Е. Е. Егорова(elena1998959@gmail.com), студент, Университет ИТМО, Санкт-Петербург, Россия. ORCID: 0000-0002-1461-0673
Е.А. Зерницкая (zernitskaya_ekaterina@mail.ru), аспирант, Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия. ORCID: 0000-0002-3819-693X
А. И. Яременко (ayaremenko@me.com), д. м. н., профессор, заведующий кафедрой хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, директор клиники челюстно-лицевой хирургии, проректор по учебной работе, Первый Санкт- Петербургский государственный медицинский университет им. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия. ORCID: 0000-0002-7700-7724
Г. Н. Черненко (office@ortos.biz), директор, Санкт-Петербургский стоматологический фрезерный центр и завод по изготовлению ортопедических компонентов «Lenmiriot», Санкт-Петербург, Россия.
С. Г. Горный(info@newlaser.ru), кандидат технических наук, ООО «Лазерный центр», Санкт-Петербург, Россия.
